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糖基化分析的重要性

單抗藥物是近年來發(fā)展最快的藥物品種，在整個藥物市場產(chǎn)值中已經(jīng)占有超過12%的份額，超過1200億美元。目前，全球已經(jīng)批準(zhǔn)的單克隆抗體藥物超過了80個，年銷售額增長率超過30%，主要應(yīng)用于惡性腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥性疾病等治療領(lǐng)域。國內(nèi)各大醫(yī)藥企業(yè)也聚焦于單抗藥物的研發(fā)。

單克隆抗體結(jié)構(gòu)主要由Fab和Fc兩大功能區(qū)組成，在Fab段和Fc段特定的位點存在糖基化修飾。這些糖基化修飾發(fā)揮著極其重要的作用：能夠維持抗體的空間構(gòu)象、穩(wěn)定抗體的結(jié)構(gòu)，提高藥物的熱穩(wěn)定性；糖鏈結(jié)構(gòu)還能保護抗體不受某些蛋白酶水解，延長半衰期，提高藥效；Fc段的糖基化修飾還會對抗體的安全性造成影響。因此抗體的糖型檢測在產(chǎn)品質(zhì)量控制中就非常重要。

目前的分析方法

糖鏈常用的分析方法有：液相色譜法、毛細管電泳法和高效陰離子交換色譜法。但無論是液相色譜法還是毛細管電泳法，都必須使用專用試劑進行熒光衍生。此衍生耗時長（4小時）且會導(dǎo)致唾液酸丟失，不能準(zhǔn)確分析含唾液酸樣品。且也無法分析磷酸化糖及硫酸化糖。而離子色譜無需衍生，定量準(zhǔn)確，可以覆蓋分析所有糖類型。

離子色譜-糖分析方法

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法，是目前領(lǐng)先的糖分析方法，具有無需衍生、分離度好、靈敏度高、同時適用所有糖修飾形態(tài)等諸多優(yōu)勢。

對于單抗藥物的復(fù)雜糖基化，離子色譜可以從三個方面給予解析：

1.糖鏈水平的分析——N糖圖譜測定

Ｎ—糖基化修飾的糖鏈可以通過肽糖苷酶Ｆ或肽糖苷酶Ａ酶切作用，或者肼解作用從糖蛋白上釋放出來。糖鏈經(jīng)凈化后可直接進樣，無需衍生，避免了衍生化過程中唾液酸化聚糖的結(jié)構(gòu)改變。

Ofatumamab的N糖圖譜

離子色譜還可以和高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，實現(xiàn)對色譜峰的鑒別。以Q Exactive為代表的Orbitrap超高分辨率質(zhì)譜對未標(biāo)記的糖具有高靈敏度，可解析糖鏈結(jié)構(gòu)。安培檢測器、高分辨質(zhì)譜和離子色譜聯(lián)用，可同時解決糖鏈的定性和定量分析。

2.單糖組成測定

單抗糖鏈主要由葡萄糖胺、半乳糖胺、巖藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等單糖組成。單糖組成測定可以從基礎(chǔ)水平上對單抗的糖組成差異給出解析。

對于中性糖和氨基糖的分析，通常使用酸水解的方式，使蛋白中的單糖釋放。樣品水解后，直接進樣，無需衍生。

3.唾液酸的測定

唾液酸存在于單抗的糖鏈末端，對于單抗在生物體內(nèi)功能的發(fā)揮起著相當(dāng)重要的作用，影響藥物的有效性。唾液酸的差異，是人源抗體和其他生物抗體差異的一個指標(biāo)。唾液酸的釋放，可使用溫和酸水解或酶解。使用離子色譜分析游離的唾液酸樣品，可直接進樣，無需衍生。不同結(jié)構(gòu)的唾液酸在CarboPac PA10色譜柱上可以得到快速高效的分離。

綜上所述，離子色譜（IC）可用于單抗藥物的聚糖圖譜分析、單糖組成分析、唾液酸測定等方面。糖型檢出覆蓋率更高，適用于復(fù)雜唾液酸修飾糖型，極大的完善和推動了糖蛋白類藥物N-糖鏈的質(zhì)控分析。

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