納米孔測(cè)序技術(shù)（又稱(chēng)第四代測(cè)序技術(shù)）是最近幾年興起的新一代測(cè)序技術(shù)。目前測(cè)序長(zhǎng)度可以達(dá)到150kb。這項(xiàng)技術(shù)開(kāi)始于90年代，經(jīng)歷了三個(gè)主要的技術(shù)革新：一、單分子DNA從納米孔通過(guò)；二、納米孔上的酶對(duì)于測(cè)序分子在單核苷酸精度的控制；三、單核苷酸的測(cè)序精度控制。目前市場(chǎng)上廣泛接受的納米孔測(cè)序平臺(tái)是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION納米孔測(cè)序儀。它的特點(diǎn)是單分子測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)（超過(guò)150kb），測(cè)序速度快，測(cè)序數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)監(jiān)控，機(jī)器方便攜帶等。這篇綜述重點(diǎn)總結(jié)了MinION測(cè)序儀的技術(shù)特點(diǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域。

一、 MinION測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介

MinION納米孔測(cè)序儀的核心是一個(gè)有2，048個(gè)納米孔，分成512組，由專(zhuān)用集成電路控制的flow cell。測(cè)序原理見(jiàn)圖1a所示：首先，將雙分子DNA連接lead adaptor（藍(lán)色），hairpin adaptor（紅色）和trailing adaptor（棕色）；當(dāng)測(cè)序開(kāi)始，lead adaptor帶領(lǐng)測(cè)序分子進(jìn)入由酶控制的納米孔，lead adaptor后是template read（即待測(cè)序的DNA分子）通過(guò)納米孔，hairpin adaptor的作用是DNA雙鏈測(cè)序的保證，然后complement read（待測(cè)序分子的互補(bǔ)鏈）通過(guò)納米孔，最后是trailing adaptor通過(guò)。在上述測(cè)序方法中，template read和complement read依次通過(guò)納米孔，利用pairwise alignment，它們組合成2D read；而在另外一種測(cè)序方法中，不使用hairpin adaptor，只測(cè)序template read，最終形成1D read。后一種測(cè)序方法通量更高，但是測(cè)序準(zhǔn)確性低于2D read。每個(gè)接頭序列（adaptor）通過(guò)納米孔引起的電流變化不同（圖1c），這種差別可以用來(lái)做堿基識(shí)別。

二、 MinION相對(duì)于其他NGS測(cè)序平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)

1、堿基修飾的檢測(cè)

納米孔測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)四種胞嘧啶（cytosine）堿基修飾，分別為5－methycytosine，5－h(huán)ydroxymethycytosine，5－formylcytosine和5－carboxylcytosine。檢測(cè)準(zhǔn)確率為92％－98％。

2、實(shí)時(shí)測(cè)序監(jiān)控

對(duì)于臨床實(shí)踐，實(shí)時(shí)獲取和分析DNA／RNA序列是一件很重要的事情。對(duì)于傳統(tǒng)的NGS測(cè)序，做到這一點(diǎn)非常不易。但對(duì)于MinION，實(shí)現(xiàn)起來(lái)相對(duì)容易。這不僅是因?yàn)镸inION體積小，易操作等，更是因?yàn)樵跍y(cè)序過(guò)程中單分子穿過(guò)納米孔，其電流變化可以檢測(cè)并識(shí)別，這種設(shè)計(jì)允許用戶(hù)在測(cè)序過(guò)程中根據(jù)實(shí)時(shí)結(jié)果做出一些判斷。

實(shí)時(shí)測(cè)序監(jiān)控對(duì)于MinION針對(duì)特定目標(biāo)序列測(cè)序有重要的應(yīng)用（圖2）：當(dāng)DNA片段通過(guò)納米孔時(shí)，如果電流變化呈現(xiàn)與目標(biāo)序列一樣的趨勢(shì)，則通過(guò)納米孔。如果DNA片段與目標(biāo)序列呈現(xiàn)不同的電流變化趨勢(shì)，則不能通過(guò)納米孔。通過(guò)這樣的方式，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的富集，從而顯著減少測(cè)序時(shí)間，對(duì)于在野外和即時(shí)診療有重要意義。

3、測(cè)得更長(zhǎng)的read

用MinION測(cè)序儀，對(duì)于1D read可以獲得300kb長(zhǎng)的read；對(duì)于2D read可以獲得60kb長(zhǎng)的read。利用MinION測(cè)序儀產(chǎn)生的長(zhǎng)read，研究人員設(shè)法填充了人參考基因組Xq24號(hào)染色體一個(gè)長(zhǎng)50kb的gap。該區(qū)域存在多個(gè)CT47基因串聯(lián)拷貝，研究人員利用MinION的長(zhǎng)read判斷該區(qū)域極有可能存在8個(gè)CT47基因拷貝（圖3）。

4、結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)

NGS短序列的特征使結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)往往不準(zhǔn)確。這個(gè)問(wèn)題在癌癥的檢測(cè)中尤其嚴(yán)重，這是因?yàn)榘┌Y組織中充斥各種結(jié)構(gòu)變異。研究人員發(fā)現(xiàn)利用MinION測(cè)得的幾百個(gè)拷貝的長(zhǎng)read得到的結(jié)構(gòu)變異結(jié)果比NGS平臺(tái)測(cè)得的上百萬(wàn)read得到的結(jié)果更可靠。

5、RNA表達(dá)分析

對(duì)于RNA表達(dá)分析，NGS平臺(tái)測(cè)得的短序列帶來(lái)的問(wèn)題是序列需要進(jìn)行拼接，才能得到轉(zhuǎn)錄本。這給可變剪切研究帶來(lái)困擾。因?yàn)橥ǔＧ闆r下NGS測(cè)序不能產(chǎn)生足夠的信息將不同形式的可變剪切區(qū)分開(kāi)來(lái)。而利用MinION測(cè)序儀產(chǎn)生的長(zhǎng)read，可以更好地解決這個(gè)問(wèn)題。研究人員利用果蠅的Dscam1基因?yàn)槔?，其存?8，612種可變剪切形式，利用MinION測(cè)序儀可以檢測(cè)到超過(guò)7，000種可變剪切形式，而這樣的結(jié)果利用NGS的短序列測(cè)序是不能夠獲得的。

6、生物信息學(xué)配套軟件的發(fā)展

近些年來(lái)，隨著生物信息分析方法的發(fā)展，MinION測(cè)序reads成功比對(duì)參考基因組的比例已經(jīng)從66％提升至92％。文章下面對(duì)各種工具的適用場(chǎng)景進(jìn)行了分別介紹。工具概述見(jiàn)表1。

1、堿基識(shí)別工具

Metrichor是ONT公司推出的基于隱馬爾可夫模型進(jìn)行堿基識(shí)別的軟件。它的使用需要網(wǎng)絡(luò)連接。MinION注冊(cè)用戶(hù)需要獲得開(kāi)發(fā)者賬號(hào)才能獲得軟件的源代碼。2016年初，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別開(kāi)發(fā)了Nanocall和DeepNano軟件。這兩個(gè)軟件都可以在本地運(yùn)行，不需要網(wǎng)絡(luò)連接。Nanocall基于隱馬爾可夫模型，可對(duì)1D read在本地進(jìn)行堿基識(shí)別；DeepNano基于recurrent neural network framework，可以獲得比隱馬爾可夫模型更準(zhǔn)確的堿基識(shí)別。

2、序列比對(duì)工具

傳統(tǒng)的NGS序列比對(duì)軟件不能滿(mǎn)足MinION序列比對(duì)的需求。這是因?yàn)镸inION測(cè)序數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率相對(duì)高且序列長(zhǎng)，即使調(diào)整參數(shù)也不能取得好的效果。在這種情況下，適合MinION測(cè)序數(shù)據(jù)的比對(duì)軟件應(yīng)運(yùn)而生。

MarginAlign是通過(guò)更好地估計(jì)MinION測(cè)序reads測(cè)序錯(cuò)誤來(lái)源從而提高與參考基因組的比對(duì)效率。通過(guò)評(píng)估檢測(cè)到的變異，發(fā)現(xiàn)其顯著提高了比對(duì)的準(zhǔn)確性。由于MarginAlign是基于LAST或BWA mem的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果的最終準(zhǔn)確性依賴(lài)最初的比對(duì)結(jié)果。

GraphMap是另一個(gè)用于MinION測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)的軟件。它利用的是一種啟發(fā)式（heuristics）方法，對(duì)高錯(cuò)誤率reads和長(zhǎng)reads進(jìn)行了優(yōu)化。一項(xiàng)研究表明GraphMap比對(duì)的靈敏性可與BLAST媲美，且它對(duì)reads測(cè)序錯(cuò)誤率的估計(jì)與MarginAlign相當(dāng)。

3、從頭組裝工具

MinION測(cè)序數(shù)據(jù)不適合利用NGS數(shù)據(jù)組裝的de Bruijn圖法進(jìn)行組裝，主要存在兩方面的原因。第一，de Bruijn圖法等方法依賴(lài)測(cè)序reads拆分的k－mer測(cè)序準(zhǔn)確，而高錯(cuò)誤率的MinION測(cè)序reads不能保證這一點(diǎn)；第二，de Bruijn圖的結(jié)構(gòu)不適用長(zhǎng)reads。

MinION測(cè)序數(shù)據(jù)的長(zhǎng)reads更適合Sanger測(cè)序時(shí)期基于有overlap的共有（consensus）序列組裝的方法。需要的是在組裝前進(jìn)行測(cè)序reads的糾錯(cuò)。第一個(gè)基于這種原理進(jìn)行組裝的研究組利用MinION數(shù)據(jù)組裝了一個(gè)完整的E． coli K－12 MG1655基因組，序列準(zhǔn)確率達(dá)到99．5％。他們利用的流程稱(chēng)為nanocorrect，首先利用graph－ based，greedy partial order aligner方法進(jìn)行糾錯(cuò)，然后利用Celera Assembler將糾錯(cuò)后的reads進(jìn)行組裝，最后利用nanopolish對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步提升。

4、單核苷酸變異檢測(cè)工具

Reference allele bias是一種在變異檢測(cè)中傾向于少檢測(cè)出變異的現(xiàn)象。該現(xiàn)象在測(cè)序reads錯(cuò)誤率高的情況下尤為嚴(yán)重。

MarginAlign中的marginCaller模塊是研究機(jī)構(gòu)開(kāi)發(fā)的適用于MinION測(cè)序數(shù)據(jù)的變異檢測(cè)軟件。MarginCaller利用maximum－likelihood參數(shù)估計(jì)和多條測(cè)序reads序列比對(duì)來(lái)檢測(cè)單核苷酸變異。當(dāng)計(jì)算機(jī)模擬出測(cè)序錯(cuò)誤為1％時(shí)，測(cè)序深度在60X，marginCaller檢測(cè)出的SNV具有97％的準(zhǔn)確率和完整度。另外一項(xiàng)研究中，研究者利用GraphMap方法，檢測(cè)人基因組的雜合變異，可以達(dá)到96％的準(zhǔn)確率。利用計(jì)算機(jī)模擬的數(shù)據(jù)，GraphMap同樣可以高準(zhǔn)確率，高完整度地檢測(cè)出結(jié)構(gòu)變異。

Nanopolish也可以用來(lái)檢測(cè)變異。它用的是event－level alignment算法。在該方法中，從參考基因組序列開(kāi)始，依次評(píng)估參考基因組序列產(chǎn)生的電信號(hào)與測(cè)序reads的相似性進(jìn)而依次修飾參考基因組序列，生成一個(gè)consensus read。直到consensus read與測(cè)序read產(chǎn)生的電信號(hào)足夠相似，將consensus read與參考基因組序列比較，得到變異。該方法在埃博拉病毒的研究中有大約80％的準(zhǔn)確性。

PoreSeq采用與Nanopolish類(lèi)似的算法。它可以利用更低深度的測(cè)序數(shù)據(jù)獲得高準(zhǔn)確率和高完整度的SNV檢測(cè)。在一項(xiàng)研究中，PoreSeq在16X測(cè)序深度下獲得99％準(zhǔn)確率和完整度的SNV檢測(cè)，與marginAlign相比，它顯著降低了測(cè)序深度。

5、共有序列的測(cè)序（consensus sequencing）方法

MinION測(cè)序數(shù)據(jù)目前只有92％的準(zhǔn)確性。在低深度測(cè)序的情況下，不能夠滿(mǎn)足類(lèi)似單體型（haplotype phasing）和人樣品的SNV檢測(cè)的要求。文章提到的解決問(wèn)題的方法是rolling circle amplication，它的原理是將一個(gè)片段進(jìn)行多次擴(kuò)增，在一個(gè)DNA分子上生成多個(gè)拷貝，這樣最終獲得的共有序列測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確率可以達(dá)到97％。

三、MinION目前的應(yīng)用領(lǐng)域

1、即時(shí)檢測(cè)傳染源

NGS測(cè)序方法可以在醫(yī)院環(huán)境下進(jìn)行傳染源等病菌的檢測(cè)，而MinION測(cè)序方法提供的是一種全新的體驗(yàn)。MinION在測(cè)序讀長(zhǎng)，攜帶的方便性，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)方面具有NGS不可比的優(yōu)勢(shì)。文獻(xiàn)記載從樣品準(zhǔn)備到發(fā)現(xiàn)致病菌只需要6小時(shí)時(shí)間，而從樣品放置機(jī)器到發(fā)現(xiàn)致病菌只需要4分鐘。文章列舉了截至目前用MinION測(cè)序儀涉及研究的物種及詳細(xì)描述了西非爆發(fā)埃博拉病毒時(shí)，MinION測(cè)序方法在病毒檢測(cè)過(guò)程中起到的重要作用。

2、非整倍體檢測(cè)

MinION可以在胎兒非整倍體產(chǎn)前檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。利用NGS平臺(tái)，通常需要1－3周時(shí)間獲得結(jié)果。而利用MinION測(cè)序方法，文獻(xiàn)報(bào)道只需要4小時(shí)。

3、太空應(yīng)用

在太空飛行中，發(fā)掘細(xì)菌和病毒是很困難的事情。大部分研究是將樣品帶回地球進(jìn)行測(cè)序鑒定。目前，NASA準(zhǔn)備利用MinION測(cè)序儀在國(guó)際空間站進(jìn)行病菌的實(shí)時(shí)測(cè)序。

四、 展望

1、PromethION

為了滿(mǎn)足研究人員對(duì)高通量測(cè)序的需求，ONT公司開(kāi)發(fā)了一個(gè)臺(tái)式納米孔測(cè)序儀—PromethION。PromethION有48個(gè)flow cell，可以單獨(dú)運(yùn)行也可以并行。每個(gè)flow cell包括3，000個(gè)通道（channel），每天產(chǎn)生6Tb測(cè)序數(shù)據(jù)。

2、測(cè)序read準(zhǔn)確性

目前MinION測(cè)序儀的測(cè)序準(zhǔn)確率在92％左右。對(duì)于類(lèi)似致病菌和可變剪切的發(fā)掘，這樣的測(cè)序準(zhǔn)確率可以滿(mǎn)足需求。但是對(duì)于臨床檢測(cè)，通常read準(zhǔn)確率需要達(dá)到99．99％。因此，文章提到ONT公司需要在測(cè)序相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)和堿基識(shí)別軟件方面進(jìn)行優(yōu)化。

另外，文章提到MinION測(cè)序方法存在非隨機(jī)的測(cè)序錯(cuò)誤。比如MinION不能很好處理長(zhǎng)于6個(gè)核苷酸的同聚物的測(cè)序，同時(shí)缺少堿基修飾檢測(cè)的內(nèi)參訓(xùn)練。如果這兩個(gè)問(wèn)題能夠得到解決，共有序列（consensus）測(cè)序的準(zhǔn)確率可以達(dá)到大于99．99％。

3、測(cè)序read長(zhǎng)度

目前MinION測(cè)序長(zhǎng)度達(dá)到150kb。在未來(lái)一段時(shí)間，可以期許其測(cè)序長(zhǎng)度可以得到更大提升。

4、RNA直接測(cè)序

逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致很多RNA自身信息的丟失，所以目前ONT公司和一些研究機(jī)構(gòu)正在嘗試用納米孔技術(shù)進(jìn)行RNA直接測(cè)序。之前的研究已經(jīng)為此奠定了基礎(chǔ)，比如研究表明可以對(duì)tRNA進(jìn)行單通道和固態(tài)納米孔（solid－state nanopore）檢測(cè)，且納米孔可以檢測(cè)DNA和tRNA的堿基修飾。

5、單分子蛋白測(cè)序

目前，質(zhì)譜（mass spectrometry）是做蛋白組分析較好的技術(shù)，但是對(duì)于靈敏性，準(zhǔn)確性和分辨率，目前的技術(shù)都存在局限性。2013年一項(xiàng)研究報(bào)道了酶介導(dǎo)的蛋白通過(guò)單通道納米孔。這項(xiàng)研究表明蛋白的序列特征可以被檢測(cè)。這些發(fā)現(xiàn)為蛋白質(zhì)納米孔測(cè)序奠定了很好的基礎(chǔ)。